实验概要：本实验利用LOWRY法来测定蛋白质含量。实验原理：Lowry法是一种结合并发展自双缩脲法和福林酚法的技术，其基本原理为：首先，将蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，进而形成铜-蛋白质的络合物；随后，加入酚试剂，不仅令肽链中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色，同时还增强了双缩脲法中肽键与碱性铜反应的显色效应。因此，Lowry法的显色强度相较于单独使用酚试剂可提高3至15倍，相比双缩脲法更是增至100倍。显色效果的提升有效降低了因蛋白质种类差异所带来的实验偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成：试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可以与蛋白质中的肽键发生显色反应；试剂乙则为磷钨酸和磷钼酸的混合液，在碱性条件下不稳定，易被酚类化合物还原生成蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，从而使得蛋白质中的酪氨酸和半胱氨酸等显色，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

主要试剂包括：Na2WO4•2H2O、Na2MoO4•2H2O、85% H3PO4、浓 HCl、Li2SO4•H2O、溴水、酚酞指示剂、Na2CO3、NaOH、CuSO4•5H2O、酒石酸钠；牛血清白蛋白需配制为250mg/ml的溶液。主要设备包括若干试管、各容量的刻度吸管、定量加样器、圆底烧瓶、冷凝管、微量滴定管、小烧杯、微量进样器和分光光度计。

实验材料为可溶性蛋白质。以下是实验步骤：

1. 酚试剂的制备

(1) 在1500ml圆底烧瓶中，取Na2WO4•2H2O 100g、Na2MoO4•2H2O 25g和700ml蒸馏水，加入85% H3PO4 50ml及浓 HCl 100ml，安装回流冷却装置，慢慢沸腾10小时。冷却后加入Li2SO4•H2O 150g、水50ml和浓 HCl 100ml，再次回流加热15分钟，以去除多余溴。冷却后稀释至100ml，并过滤至棕色瓶中，存于冰箱中。使用时以标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，终点由蓝变灰，计算酸浓度，稀释至最终浓度为1mol/L H+，得到Folin-酚试剂乙溶液。

(2) 配制4% Na2CO3溶液、0.2mol/L NaOH溶液、1% CuSO4及2% 酒石酸钠溶液，使用前将Na2CO3与NaOH等体积混合，得到Na2CO3-NaOH溶液，将CuSO4与酒石酸钠等体积混合，得到硫酸铜-酒石酸钠溶液。然后将这两种溶液按50:1混合，制成Folin-酚试剂甲，此试剂仅可使用一天。

2. 标准曲线的绘制

(1) 准备7只试管，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml标准蛋白质溶液，用水补至1ml，形成标准系列（蛋白质含量分别为0mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg，必要时可重复）。

(2) 加入5ml试剂甲，混匀，并在30℃下放置10分钟。

(3) 快速加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30℃下保温30分钟。

(4) 准确到30分钟后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色，测定吸光度值。

(5) 以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

3. 样品测定

(1) 取50μl样液加入试管中，样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定，加入蒸馏水补至1ml，重复步骤2的（2）、（3）、（4），以空白为参比，测定吸光度值。

(2) 根据吸光度值查标准曲线以求得蛋白质含量。

4. 结果计算

蛋白质含量（mg/g鲜重）= (C*V/a)/W

公式中，C为查标准曲线得的样品测定管中的蛋白质含量（mg），V为提取液总量（ml），a为测定时取样液量（ml），W为取样量（g）。

注意事项

1. Folin试剂乙在酸性条件下稳定，因此当其添加至碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混匀，以确保磷钼酸-磷钨酸试剂未受损害前，能够顺利进行还原反应。

2. 为确保反应的完全进行，需在25℃至30℃的水浴中进行反应，反应30分钟后及时比色。

3. 有些还原物质对本实验可能造成干扰。考马斯亮蓝法和LOWRY法是两种高灵敏度的蛋白质定量测定方法，前者稳定而后者简便，均优于现有的其它方法。然而，两者也存在一定的缺点：Lowry法容易受到植物体内酚类物质的干扰，而考马斯亮蓝法在蛋白质含量过高时，线性关系稍有偏差。此外，不同蛋白质与色素的结合情况也存在差异。

在生物医疗的相关领域中，掌握蛋白质的含量测定方法至为重要。尊龙凯时(中国区)人生就是搏，期待这一方法能够为未来的生物医疗研究提供有力支持。